磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)(EC 3.1.4.4)是一類能水解磷脂質(zhì)生成磷脂酸和羥基化合物的酶[1]。除了具有水解活性外，PLD還可通過磷酰基轉(zhuǎn)移作用催化磷脂質(zhì)極性頭部基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而將大量磷脂酰膽堿(PC)催化合成為自然界稀有的磷脂質(zhì)，如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)等[2-3]。合成的磷脂質(zhì)在食品、化妝品、藥品中具有重要應(yīng)用價(jià)值[1]。目前，磷脂酶D已成為合成和改造磷脂質(zhì)的重要工具[1]。從催化反應(yīng)過程看，無論是催化磷脂質(zhì)水解反應(yīng)還是磷酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，由于磷脂酶D的反應(yīng)底物是不溶于水的磷脂，因此與脂肪酶類似，磷脂酶D也屬于界面酶。界面酶催化水解反應(yīng)的進(jìn)程大致可分為兩步，首先水中游離的酶蛋白在脂質(zhì)底物存在的條件下，從水相聚集到“脂質(zhì)-水界面”上。其次，脂質(zhì)底物進(jìn)入酶蛋白催化活性中心，發(fā)生相應(yīng)的催化反應(yīng)，生成目的產(chǎn)物[4]。已有研究表明，“磷脂質(zhì)-水界面”的存在以及界面的質(zhì)量對(duì)于磷脂酶D活力的充分發(fā)揮具有重要影響[5]。而界面吸附作為酶催化反應(yīng)的首要步驟，在該過程中發(fā)揮著重要作用。但目前對(duì)于磷脂酶D而言，大部分研究集中在利用其進(jìn)行特定結(jié)構(gòu)磷脂的合成[3]，對(duì)于酶蛋白對(duì)脂質(zhì)界面吸附特性的研究鮮有報(bào)道。

來源于哈維氏弧菌的磷脂酶D是新發(fā)現(xiàn)的一種酶，目前對(duì)于該酶的酶學(xué)特性尤其是該酶對(duì)不同磷脂底物的吸附動(dòng)力學(xué)尚未見有相關(guān)報(bào)道。單分子層膜是目前公認(rèn)的研究酶蛋白與脂質(zhì)相互作用的經(jīng)典模型[6]。基于單分子層技術(shù)可實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)單分子層-水界面特性的精準(zhǔn)控制，從而為分子水平研究酶蛋白在磷脂質(zhì)-水界面上的吸附動(dòng)力學(xué)奠定基礎(chǔ)[7-9]。本研究首次利用單分子層技術(shù)研究該酶對(duì)不同磷脂底物的吸附動(dòng)力學(xué)，以期深入了解該酶的界面吸附特性以及針對(duì)該酶進(jìn)行開發(fā)與應(yīng)用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1原料與試劑

L-α-磷脂酰膽堿(≥97%)、L-α-磷脂酰肌醇(≥99%)，L-α-磷脂酰絲氨酸(≥97%)，L-α-磷脂酰乙醇胺(≥99%)，L-α-磷脂酰甘油(≥98%)，均購(gòu)于Sigma公司；氨芐抗生素、pET21a表達(dá)載體、誘導(dǎo)劑IPTG，均購(gòu)于Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備

葡聚糖凝膠G-25柱(1 000～5 000 Da，1 cm×20 cm，GEHealthcare Bio-Science AB)，Q柱(5 mL預(yù)裝柱，嫁接葡聚糖的Seplite 6FF，配體—CH2N+(CH3)Cl-，粒徑50～150μm，流速300～500 cm/h，工作溫度4～40℃，pH范圍2～12，儲(chǔ)存緩沖液20%乙醇，溫度4～8℃)，HYG-C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，JY92-IIN超聲破碎儀，Biologic LP蛋白層析儀(Bio-Rad公司)，ELx800酶標(biāo)儀(BioTek公司)，Micro TroughX LB膜分析儀(配備有界面吸附專用反應(yīng)槽，芬蘭Kibron公司)，DTCZ-240N SDS-PAGE電泳儀，Triple TOF 5600 LC-MS質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1失活型哈維氏弧菌磷脂酶D大腸桿菌重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

首先，從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中下載哈維氏弧菌磷脂酶D的完整蛋白序列(GenBank:WP_005435673.1)。用在線信號(hào)肽分析軟件SignalP 4.1 server對(duì)其信號(hào)肽進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。去掉N端24個(gè)信號(hào)肽氨基酸后的蛋白序列稱為成熟蛋白序列。編碼磷脂酶D成熟蛋白(VhPLD)的基因序列委托上海生工生物工程有限公司參照大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)在優(yōu)化的基因序列N端和C端分別添加NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)并進(jìn)行全基因序列的合成。合成的VhPLD基因用NdeI和XhoI內(nèi)切酶酶切后連入用相同內(nèi)切酶進(jìn)行酶切的pET21a表達(dá)載體。將構(gòu)建的質(zhì)粒pET21a-VhPLD轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。為了避免酶水解磷脂從而對(duì)酶蛋白的吸附過程研究造成干擾，在已經(jīng)構(gòu)建的pET21a-VhPLD表達(dá)載體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步引入針對(duì)催化活性位點(diǎn)His157的單點(diǎn)突變(H157A)，從而使表達(dá)酶蛋白喪失水解活性。單點(diǎn)突變體的構(gòu)建采用重疊延伸法進(jìn)行。將構(gòu)建的突變體pET21a-VhPLD-H157A轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到E.coliShuffleT7感受態(tài)細(xì)胞中，陽性克隆鑒定成功后，獲得失活型哈維氏弧菌磷脂酶D的大腸桿菌重組表達(dá)菌株。

1.2.2失活型VhPLD的表達(dá)與純化

將重組表達(dá)菌株接種于5 mL含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基(0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl)中，37℃下過夜培養(yǎng)，制備種子液。按5%接種量接種放大于含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min下培養(yǎng)2～3 h至OD600為0.6～0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG，至終濃度為0.05 mmol/L。調(diào)整培養(yǎng)溫度到20℃，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24 h。將誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵菌液離心(8 000 r/min，6 min，4℃)，去上清液，菌體用50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl(pH 8.0)重懸，超聲破碎15 min，離心(10 000 r/min，15 min，4℃)，收集破碎上清，用0.45μm濾膜過濾。將收集到的破碎上清液進(jìn)行Ni2+親和層析。蛋白上樣后，用Buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)沖洗，緊接著用Buffer B(含有100～500 mmol/L咪唑的Buffer A)進(jìn)行梯度洗脫，收集出峰的蛋白樣品。將100 mmol/L咪唑梯度洗脫收集的出峰樣品用G-25柱脫鹽后，上樣Q柱陰離子交換層析，最終用含有300 mmol/L氯化鈉的緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脫得到目的蛋白樣品。所得到的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)其純度，用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定其蛋白濃度，用Triple TOF 5600 LC-MS(AB SCIEX)質(zhì)譜儀進(jìn)行LC-MS/MS鑒定分析。

1.2.3 VhPLD對(duì)不同磷脂單分子層吸附動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

2結(jié)果與討論

2.1失活型哈維氏弧菌磷脂酶D的表達(dá)與純化

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比于酵母表達(dá)系統(tǒng)，具有發(fā)酵周期短的優(yōu)勢(shì)。考慮到所表達(dá)目的蛋白來源于哈維氏弧菌這一原核細(xì)胞，因此在構(gòu)建VhPLD重組表達(dá)體系的選擇上，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成為本研究的首選。誘導(dǎo)表達(dá)后的電泳結(jié)果表明，雖然有部分目的蛋白以包涵體的形式存在于菌體破碎后的離心沉淀中，但破碎上清液中仍有部分可溶性蛋白存在。將破碎細(xì)胞上清液首先采用Ni2+親和層析純化，目的蛋白在含有100 mmol/L咪唑的Buffer A洗脫峰樣品中得以富集。洗脫峰樣品用G25柱脫鹽去除所含有的咪唑后，用Q柱陰離子交換層析對(duì)樣品作進(jìn)一步純化。目的蛋白用含有300 mmol/L氯化鈉的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗脫緩沖液洗脫。電泳結(jié)果(如圖1)表明，在54 kDa左右處有明顯的條帶，蛋白大小與預(yù)期的結(jié)果類似(預(yù)測(cè)理論相對(duì)分子質(zhì)量53 450.65 Da)。同時(shí)，取該蛋白條帶用Triple TOF 5600 LC-MS(AB SCIEX)質(zhì)譜儀進(jìn)行LC-MS/MS分析鑒定，確認(rèn)該條帶即為要表達(dá)的目的蛋白。

圖1失活型VhPLD的表達(dá)與純化SDS-PAGE電泳圖注：1.蛋白marker；2.菌體破碎液；3.菌體破碎后離心所得上清液；4.菌體破碎后離心所得沉淀；5.鎳柱純化所得100 mmol/L咪唑洗脫峰樣品；6.鎳柱純化的上樣穿過峰樣品；7.G-25柱純化的洗脫峰樣品；8.Q柱純化的300 mmol/L氯化鈉梯度洗脫峰樣品。

LB膜分析儀應(yīng)用：不同初始表面壓力條件對(duì)VhPLD的磷脂吸附親和力影響（一）

LB膜分析儀應(yīng)用：不同初始表面壓力條件對(duì)VhPLD的磷脂吸附親和力影響（二）